生物技術(shù)和生命科學將成為 21世紀引發(fā)新科技革命的重要推動力量，人類所面臨的健康、疾病、食品、醫(yī)藥制造、能源、環(huán)境等一系列問題成為這一時期最重要的內(nèi)容。以微生物發(fā)酵技術(shù)為核心的新一代工業(yè)生物技術(shù)正在發(fā)揮越來越重要的作用，功能菌株（高產(chǎn)菌種）的構(gòu)建與大規(guī)模篩選技術(shù)被列為重點研究的新一代工業(yè)生物技術(shù)之一。
1、國內(nèi)外菌種生產(chǎn)水平存在差距
全世界微生物發(fā)酵產(chǎn)品市場規(guī)模約為 200億美元，其中抗生素占 46%，從世界趨勢看，抗生素市場正以 8%的平均年增長率高速發(fā)展，而我國市場每年的增長更是超過 20%。幾大抗生素品種的原料藥生產(chǎn)主要集中在我國。如我國青霉素年產(chǎn)量超過 6萬噸，占世界份額約 90%，原料藥銷售中有超過 60%為出口。再如維生素 C全球產(chǎn)能超過 13萬噸，需求量一般保持在 9萬噸左右，主要由六大企業(yè)掌控：石家莊制藥集團、華北制藥集團、東北制藥集團、江山制藥有限公司以及荷蘭帝斯曼公司和德國巴斯夫公司。而國內(nèi)四大企業(yè)產(chǎn)能已經(jīng)超過 9萬噸，中國已成為全世界維生素 C供應(yīng)商主要基地，中國維生素 C出口的國家和地區(qū)超過 150個。我國已經(jīng)成為名副其實的發(fā)酵大國，但是由于種種原因，我國的發(fā)酵技術(shù)水平仍處于落后地位，其中菌種的發(fā)酵水平與國外先進技術(shù)相比有相當大的差距。如青霉素國外菌種發(fā)酵效價為每毫升發(fā)酵液近20萬單位，而我國目前只有 10萬單位左右；紅霉素發(fā)酵能力國際上已經(jīng)超過 1.5萬單位 /mL，國內(nèi)最高水平僅有8000～ 10000單位 /mL。我國其他發(fā)酵產(chǎn)品的菌種生產(chǎn)能力基本上都同樣面臨落后于國際水平的局面。因此，提高工業(yè)生產(chǎn)菌種的發(fā)酵能力是提升我國發(fā)酵工業(yè)整體水平的重要基礎(chǔ)。
2、我國菌種選育技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀
常用的菌種選育技術(shù)（ strain improvement）根據(jù)其原理可分成隨機選育（ random screening）和理性選育（rationalized selection）兩大類 ①。雖然以分子生物學為基礎(chǔ)的基因工程、代謝工程以及由各種組學組成的系統(tǒng)生物學研究為定向構(gòu)建功能細胞株提供了廣闊前景，但要真正實現(xiàn)以這些功能細胞培養(yǎng)來達到改造目標卻極其困難。由于微生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的復雜性和多結(jié)點性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著預期設(shè)計的方向轉(zhuǎn)移。尤其是在產(chǎn)生抗生素等次級代謝產(chǎn)物的復雜體系中，要想得到優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要還是采用隨機選育技術(shù)，包括自然選育、誘變育種和以原生質(zhì)體融合為代表的雜交育種技術(shù)，但篩選工作量大，費時費力。這是因為產(chǎn)量的高低屬于數(shù)量性狀，遺傳學上由多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能逐漸積累到一定的高產(chǎn)特性，這一點不同于以發(fā)現(xiàn)化合物為目標的菌種篩選。因此從菌種選育實踐來看除了一些用代謝工程方法改造的初級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌株外，不論采用隨機選育還是理性選育，都無法繞開大量繁瑣的菌株篩選工作 ② 。另一方面，無論是隨機選育還是理性選育，經(jīng)典的菌種初篩和復篩都是在沒有任何檢測參數(shù)的搖瓶或試管中進行的，篩選過程微生物的外在培養(yǎng)環(huán)境與工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)存在巨大反差，很多真正符合實際生產(chǎn)環(huán)境、性狀優(yōu)良的菌種往往在篩選初期就被漏篩掉了 ； 菌種篩選和篩選后發(fā)酵工藝設(shè)計與優(yōu)化工作是分開、順序進行的，兩者之間缺少技術(shù)參數(shù)的聯(lián)系，導致?lián)u瓶篩選到的優(yōu)良菌株與實際工藝條件產(chǎn)生不對應(yīng)性，因而許多優(yōu)良菌株的高產(chǎn)性能很難在工業(yè)生產(chǎn)中體現(xiàn)出來。這種篩選模式在我國沿用了半個多世紀而沒有明顯改進。由此可見，在菌種選育領(lǐng)域，亟需開展多參數(shù)的與發(fā)酵工藝過程相結(jié)合的高通量菌種篩選技術(shù)和方法的研究。
3 、高通量菌種篩選的國際研究進展
近幾年用于微生物菌種高通量篩選（high-throughput screening）的裝置及相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展和成熟 ③～ 。國外發(fā)明了多種全自動高通量篩選系統(tǒng)，可以進行培養(yǎng)基滅菌、 倒平板、 挑取單菌落、分裝發(fā)酵培養(yǎng)基、接種、抽提、HPLC（高效液相色譜）分析和數(shù)據(jù)自動收集處理等過程，即組合成一套連續(xù)的自動化系統(tǒng)，實現(xiàn)高效自動化篩選，從而大大提高篩選效率。國際上菌種篩選技術(shù)正朝著高通量、微型化、自動化和儀器化方向發(fā)展，其中生物反應(yīng)器微型化是當前發(fā)展的重要趨勢。如美國馬里蘭大學、 麻省理工學院、 德國雷根斯堡大學、英國倫敦大學等都在加緊開發(fā)具備高通量特性的微型生物反應(yīng)器 ③ ~ ⑧ ，有些產(chǎn)品已經(jīng)在不少大型制藥公司得到商品化應(yīng)用。
3.1 微型生物反應(yīng)器
目前國際上出現(xiàn)的微型生物反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上大體包括三類 ： 孔板式微反應(yīng)器（microtiter plate，MTP，參見圖 1） ④～⑥ 、基于現(xiàn)有搖瓶或發(fā)酵罐原型縮微化的分體式微反應(yīng)器（miniature bioreactor，MBR，參見圖 2） ⑦ 和微流控芯片實驗室（microfluid-based lab-on-a-chip，參見圖 3） ⑧～⑩ 。微型生物反應(yīng)器雖然形式各異，但都具有以下功能和特點 ： ①多參數(shù)在線檢測功能，可同時測量 pH 值、DO（dissvloed oxygen，溶解氧） 、 P co 2 、OD（optical density，光密度）等重要參數(shù) ； ②高通量分析功能，在一臺微反應(yīng)器上集成的微發(fā)酵罐數(shù)可達 6、12、24、48、96 個不等 ； ③體積小，其體積一般小于 100 mL，有的甚至小至 5mL ，微流控芯片則為 nL 級規(guī)模。此外，還有造價低、減少昂貴原材料消耗、降低勞動強度等優(yōu)勢。生物反應(yīng)器的微型化主要是基于光化學傳感技術(shù)在發(fā)酵中的成功應(yīng)用。光化學傳感器的測定原理是 ： 特定波長的激發(fā)光照射到事先加入培養(yǎng)基內(nèi)的某種熒光染料指示劑或固定于生物反應(yīng)器內(nèi)壁上含有熒光染料指示劑的（patch，即化學傳感器）上（參見圖 4） ，指示劑產(chǎn)生發(fā)射光或光吸收，并被檢測器檢測到，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)氧氣或二氧化碳含量的不同（或 pH 值變化） ，檢測到的熒光強度也不同，據(jù)此而定量溶液中的 DO、P co 2 或 pH 值。與過去基于電化學原理設(shè)計的傳感器不同，光化學傳感器是一種非接觸式傳感器（non-invasive sensor） ，因此最大程度地減少了在線檢測對發(fā)酵狀態(tài)的干擾，也解決了染菌問題 ，且便于縮小反應(yīng)器。而且光化學傳感器成本低廉，其費用為傳統(tǒng)電化學電極的1/20 ～1/10。
3.2 孔板式微反應(yīng)器（MTP）
微孔板是自動高效篩選的標準方式 ： 篩選自動化，結(jié)果定量化，可與自動化機械、液體處理系統(tǒng)、光學讀板儀等相匹配。MTP 有各種格式可提供（6~1536孔） ，但 24 孔、48 孔和 96 孔格式是最常用的。MTP 最先是在分析領(lǐng)域得到 應(yīng)用，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于組合化學、生物轉(zhuǎn)化、 微生物發(fā)酵和細胞培養(yǎng)篩選研究。美國 Biolog 公司開發(fā)了一種表型分析微陣列（phenotype microArray，PM）系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以同時提供 2000 多種不同的培養(yǎng)條件，用以檢測微生物的生長、呼吸、代謝等不同的表型。該高通量培養(yǎng)系統(tǒng)包含了 200 種碳源、400 種氮源、100 多種磷源和硫源、100 種營養(yǎng)補充劑以及不同范圍的 pH 值、滲透壓、離子濃度等生長環(huán)境。通過這些預設(shè)的生長條件，可以實現(xiàn)對不同品系細胞或突變體的生理特性或遺傳特性的快速和高通量檢測。目前，該系統(tǒng)已經(jīng)成功地在數(shù)千種不同的細菌、真菌、哺乳動物細胞的表型快速篩選中得到了成功應(yīng)用。這對藥物開發(fā)、微生物檢測、食品安全等相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響力。M24 是一個深孔板格式的微型反應(yīng)器系統(tǒng)（參見圖 1） ，包含 24 個圓柱形無擋板的深孔（微反應(yīng)器） ，工作體積為5mL。每個孔內(nèi)配置了非接觸式 pH 值、DO 和溫度傳感器、熱導體、0.2mm 噴氣膜（可透過混合空氣、氧氣、氮氣、二氧化碳和氨，參見圖 4） 。每個孔上端用透氣帽密封，起到隔菌的作用。M24 深孔板可置于溫育箱中培養(yǎng)。Chen 等首次報道了用 M24 作為常規(guī)實驗室規(guī)模發(fā)酵罐的縮小模型進行動物細胞懸浮培養(yǎng)工藝開發(fā)？疾炝 pH 值、DO 測量、溫度控制的精度 （參見圖 5 和圖 6） 。從 pH 值、DO、溫度、細胞生長、產(chǎn)物形成和蛋白質(zhì)量參數(shù)方面與 2L 工作體積的常規(guī)臺式反應(yīng)器進行了比較，結(jié)果顯示有很好的一致性，說明該系統(tǒng)適合作為細胞培養(yǎng)過程研究的縮小模型應(yīng)用。
3.3 分體式微型生物反應(yīng)器（MBR）
Harms 等報道了一種 24 位分體式MBR 系統(tǒng)（參見圖 2） ，每個反應(yīng)器的工作體積為 1mL。除為每一個微型反應(yīng)器配備獨立的非接觸式在線 DO、pH 值傳感器外，還安裝了由步進電機驅(qū)動的攪拌控制，最大可以提供 1000 r/min 的轉(zhuǎn)速。這個系統(tǒng)的優(yōu)勢是每個微型反應(yīng)器可以滅菌、允許放在凈化臺上操作、各個反應(yīng)器可以控制不同的轉(zhuǎn)速。該系統(tǒng)在 E.coli 發(fā)酵中表現(xiàn)出很好的 DO、pH值、OD 的重現(xiàn)性和控制 DO 的可能性。Ge 等報道 12 個微型發(fā)酵罐組成的 MBR系統(tǒng)，微反應(yīng)器的直徑是 30mm，高度為 78mm，工作體積大約為 30mL（參見圖 7） 。每個反應(yīng)器底部同樣配備了傳感器，以SP20/0 骨髓瘤 / 鼠雜交瘤細胞系為試驗對象，通過轉(zhuǎn)錄分析表明光傳感系統(tǒng)不影響細胞生理特性。
3.4 微流控芯片系統(tǒng)
近年來微流控技術(shù)的發(fā)展為微生物用 PMMA 制作了一種可實現(xiàn) OD、pH值和溶解氧實時監(jiān)測的微流控連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)器 ⑧ （參見圖 3） 。Groisman 等利用PDMS 加工制作微腔陣列作為高通量的微生物發(fā)酵反應(yīng)器 ⑨ ，該芯片通過在相鄰的微腔之間設(shè)計壩形結(jié)構(gòu)將微生物細胞群體限制于各微腔內(nèi)生長，同時保證液體通過壩形結(jié)構(gòu)在各微腔中的流動，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)的更新和代謝產(chǎn)物的移出，該微型發(fā)酵反應(yīng)器可以簡單地實現(xiàn)高通量的微生物連續(xù)發(fā)酵。Zhang 利用該發(fā)酵芯片進行了大腸桿菌和酵母細胞的高密度培養(yǎng)實驗以及單細胞生長監(jiān)測實驗。不過，該發(fā)酵芯片功能過于簡單，僅包含菌種導入和營養(yǎng)物質(zhì)更新功能以及一個可調(diào)節(jié)因素 —— 溫度，與實際發(fā)酵控制過程相差較遠。且該芯片無法避免細菌生物薄膜（biofilm）的形成（細菌生物薄膜會消耗大量生長底物） ，難以保證發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵工作的長期有效性和穩(wěn)定性。加州理工學院的Balagaddé 等利用多層軟光刻技術(shù)制作了一種基于半連續(xù)發(fā)酵方式的微流控發(fā)酵反應(yīng)器 ⑩ ，該芯片包含 6 個獨立平行運行的 16 nL 發(fā)酵單元，每個單元通過精細設(shè)計和密集排列的微通道、微閥和微泵來實現(xiàn)微生物發(fā)酵過程中的多步處理過程。每個發(fā)酵循環(huán)操作除了不斷灌注營養(yǎng)物質(zhì)和排出發(fā)酵液外，還涉及一個裂解液灌注、清洗的操作，該操作可防止發(fā)酵芯片管壁上形成細菌生物薄膜，保證發(fā)酵芯片長期工作的有效性和穩(wěn)定性。雖然該芯片具有較完善的功能，但是通量較低（僅 6 個獨立單元） 。隨著微型化技術(shù)的出現(xiàn)，微流控裝置的開發(fā)顯著增長。研究表明微流控系統(tǒng)在提高分析性能、降低實驗室安全要求、降低成本，縮短分析時間和減少試劑用量方面是非常有前景的 
3.5 機器人系統(tǒng)
機器人系統(tǒng)從 20 世紀 90 年代后首先開始在化學和藥物領(lǐng)域中用于開展化學分析，后來對標準的實驗室自動化方案進行適當修改，用于工業(yè)發(fā)酵工藝開發(fā)。不同于在生化分析研究中的應(yīng)用，微生物培養(yǎng)對機器人系統(tǒng)有一些特殊要求，比如足夠的氧供應(yīng)、適宜的生長溫度控制、盡可能小的樣品蒸發(fā)以及避免交叉污染和簡單可靠的過程控制。圖 8 是 基 于 Sagian Core System 和SAMI 3.3 控制軟件（Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA） 集 成 的 自 動 化 高 通量發(fā)酵系統(tǒng) ，整個機器人系統(tǒng)被安裝在一個封閉的箱體內(nèi)，箱體尺寸是4.9m×2.3m×2.2m。整個箱體有溫濕度控制，并集成了頂部中央軌道機械手、條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計、離心機、冷藏室等。這個自動化系統(tǒng)可以在沒有手工介入的情況下平行地實現(xiàn)樣品準備、運行、監(jiān)控 768 個（16 個 48 孔板）好氧微型化發(fā)酵實驗，雖然期間因采用了
半連續(xù)熒光檢測技術(shù)而要求短暫的停止震搖，但這并不明顯影響細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果。該系統(tǒng)以 E.coli 和 Saccharomyces
cerevisiae 為培養(yǎng)對象進行了功能驗證，
4、展 望
就我國科研單位和企業(yè)的經(jīng)濟實力而言，近期甚至將來很長一段時期內(nèi)尚無法推廣國外這些價格高昂、自動化程度高的高通量篩選設(shè)備，因此自主研發(fā)基于微反應(yīng)器的高通量工業(yè)生產(chǎn)菌種的篩選技術(shù)和裝置是提高我國功能菌株大規(guī)模篩選技術(shù)的必經(jīng)之路，形勢刻不容緩，否則會造成與國外菌種技術(shù)差距越來越大？上驳氖菄鴥(nèi)開展了這方面的研究開發(fā)工作 ，上海百侖在微型生物反應(yīng)器及多通道生物反應(yīng)器的研究與制造方面走在前沿
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