微型生物反應(yīng)器與高通量菌種篩選

 

       生物技術(shù)和生命科學(xué)將成為 21世紀(jì)引發(fā)新科技革命的重要推動(dòng)力量，人類所面臨的健康、疾病、食品、醫(yī)藥制造、能源、環(huán)境等一系列問(wèn)題成為這一時(shí)期最重要的內(nèi)容。以微生物發(fā)酵技術(shù)為核心的新一代工業(yè)生物技術(shù)正在發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，功能菌株（高產(chǎn)菌種）的構(gòu)建與大規(guī)模篩選技術(shù)被列為重點(diǎn)研究的新一代工業(yè)生物技術(shù)之一。

1、國(guó)內(nèi)外菌種生產(chǎn)水平存在差距

        全世界微生物發(fā)酵產(chǎn)品市場(chǎng)規(guī)模約為 200億美元，其中抗生素占 46%，從世界趨勢(shì)看，抗生素市場(chǎng)正以 8%的平均年增長(zhǎng)率高速發(fā)展，而我國(guó)市場(chǎng)每年的增長(zhǎng)更是超過(guò) 20%。幾大抗生素品種的原料藥生產(chǎn)主要集中在我國(guó)。如我國(guó)青霉素年產(chǎn)量超過(guò) 6萬(wàn)噸，占世界份額約 90%，原料藥銷售中有超過(guò) 60%為出口。再如維生素 C全球產(chǎn)能超過(guò) 13萬(wàn)噸，需求量一般保持在 9萬(wàn)噸左右，主要由六大企業(yè)掌控：石家莊制藥集團(tuán)、華北制藥集團(tuán)、東北制藥集團(tuán)、江山制藥有限公司以及荷蘭帝斯曼公司和德國(guó)巴斯夫公司。而國(guó)內(nèi)四大企業(yè)產(chǎn)能已經(jīng)超過(guò) 9萬(wàn)噸，中國(guó)已成為全世界維生素 C供應(yīng)商主要基地，中國(guó)維生素 C出口的國(guó)家和地區(qū)超過(guò) 150個(gè)。我國(guó)已經(jīng)成為名副其實(shí)的發(fā)酵大國(guó)，但是由于種種原因，我國(guó)的發(fā)酵技術(shù)水平仍處于落后地位，其中菌種的發(fā)酵水平與國(guó)外先進(jìn)技術(shù)相比有相當(dāng)大的差距。如青霉素國(guó)外菌種發(fā)酵效價(jià)為每毫升發(fā)酵液近20萬(wàn)單位，而我國(guó)目前只有 10萬(wàn)單位左右；紅霉素發(fā)酵能力國(guó)際上已經(jīng)超過(guò) 1.5萬(wàn)單位 /mL，國(guó)內(nèi)最高水平僅有8000～ 10000單位 /mL。我國(guó)其他發(fā)酵產(chǎn)品的菌種生產(chǎn)能力基本上都同樣面臨落后于國(guó)際水平的局面。因此，提高工業(yè)生產(chǎn)菌種的發(fā)酵能力是提升我國(guó)發(fā)酵工業(yè)整體水平的重要基礎(chǔ)。

2、我國(guó)菌種選育技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

         常用的菌種選育技術(shù)（ strain impr­ovement）根據(jù)其原理可分成隨機(jī)選育（ random screening）和理性選育（rationalized selection）兩大類 ^①。雖然以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的基因工程、代謝工程以及由各種組學(xué)組成的系統(tǒng)生物學(xué)研究為定向構(gòu)建功能細(xì)胞株提供了廣闊前景，但要真正實(shí)現(xiàn)以這些功能細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)達(dá)到改造目標(biāo)卻極其困難。由于微生物體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和多結(jié)點(diǎn)性，基因操作后菌株的代謝流往往并不朝著預(yù)期設(shè)計(jì)的方向轉(zhuǎn)移。尤其是在產(chǎn)生抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的復(fù)雜體系中，要想得到優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株，主要還是采用隨機(jī)選育技術(shù)，包括自然選育、誘變育種和以原生質(zhì)體融合為代表的雜交育種技術(shù)，但篩選工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。這是因?yàn)楫a(chǎn)量的高低屬于數(shù)量性狀，遺傳學(xué)上由多基因決定，一次誘變和篩選很難有大幅度提高，需要多輪誘變篩選才能逐漸積累到一定的高產(chǎn)特性，這一點(diǎn)不同于以發(fā)現(xiàn)化合物為目標(biāo)的菌種篩選。因此從菌種選育實(shí)踐來(lái)看除了一些用代謝工程方法改造的初級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌株外，不論采用隨機(jī)選育還是理性選育，都無(wú)法繞開大量繁瑣的菌株篩選工作 ② 。另一方面，無(wú)論是隨機(jī)選育還是理性選育，經(jīng)典的菌種初篩和復(fù)篩都是在沒(méi)有任何檢測(cè)參數(shù)的搖瓶或試管中進(jìn)行的，篩選過(guò)程微生物的外在培養(yǎng)環(huán)境與工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)存在巨大反差，很多真正符合實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境、性狀優(yōu)良的菌種往往在篩選初期就被漏篩掉了 ； 菌種篩選和篩選后發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)與優(yōu)化工作是分開、順序進(jìn)行的，兩者之間缺少技術(shù)參數(shù)的聯(lián)系，導(dǎo)致?lián)u瓶篩選到的優(yōu)良菌株與實(shí)際工藝條件產(chǎn)生不對(duì)應(yīng)性，因而許多優(yōu)良菌株的高產(chǎn)性能很難在工業(yè)生產(chǎn)中體現(xiàn)出來(lái)。這種篩選模式在我國(guó)沿用了半個(gè)多世紀(jì)而沒(méi)有明顯改進(jìn)。由此可見(jiàn)，在菌種選育領(lǐng)域，亟需開展多參數(shù)的與發(fā)酵工藝過(guò)程相結(jié)合的高通量菌種篩選技術(shù)和方法的研究。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 、高通量菌種篩選的國(guó)際研究進(jìn)展
        近幾年用于微生物菌種高通量篩選（high-throughput screening）的裝置及相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展和成熟 ③～ 。國(guó)外發(fā)明了多種全自動(dòng)高通量篩選系統(tǒng)，可以進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌、 倒平板、 挑取單菌落、分裝發(fā)酵培養(yǎng)基、接種、抽提、HPLC（高效液相色譜）分析和數(shù)據(jù)自動(dòng)收集處理等過(guò)程，即組合成一套連續(xù)的自動(dòng)化系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高效自動(dòng)化篩選，從而大大提高篩選效率。國(guó)際上菌種篩選技術(shù)正朝著高通量、微型化、自動(dòng)化和儀器化方向發(fā)展，其中生物反應(yīng)器微型化是當(dāng)前發(fā)展的重要趨勢(shì)。如美國(guó)馬里蘭大學(xué)、 麻省理工學(xué)院、 德國(guó)雷根斯堡大學(xué)、英國(guó)倫敦大學(xué)等都在加緊開發(fā)具備高通量特性的微型生物反應(yīng)器 ③ ~ ⑧ ，有些產(chǎn)品已經(jīng)在不少大型制藥公司得到商品化應(yīng)用。

 

 

 3.1　微型生物反應(yīng)器
      目前國(guó)際上出現(xiàn)的微型生物反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上大體包括三類 ： 孔板式微反應(yīng)器（microtiter plate，MTP，參見(jiàn)圖 1） ④～⑥ 、基于現(xiàn)有搖瓶或發(fā)酵罐原型縮微化的分體式微反應(yīng)器（miniature bioreactor，MBR，參見(jiàn)圖 2） ⑦ 和微流控芯片實(shí)驗(yàn)室（microfluid-based lab-on-a-chip，參見(jiàn)圖 3） ⑧～⑩ 。微型生物反應(yīng)器雖然形式各異，但都具有以下功能和特點(diǎn) ： ①多參數(shù)在線檢測(cè)功能，可同時(shí)測(cè)量 pH 值、DO（dissvloed oxygen，溶解氧） 、 P co 2 、OD（optical density，光密度）等重要參數(shù) ； ②高通量分析功能，在一臺(tái)微反應(yīng)器上集成的微發(fā)酵罐數(shù)可達(dá) 6、12、24、48、96 個(gè)不等 ； ③體積小，其體積一般小于 100 mL，有的甚至小至 5mL ，微流控芯片則為 nL 級(jí)規(guī)模。此外，還有造價(jià)低、減少昂貴原材料消耗、降低勞動(dòng)強(qiáng)度等優(yōu)勢(shì)。生物反應(yīng)器的微型化主要是基于光化學(xué)傳感技術(shù)在發(fā)酵中的成功應(yīng)用。光化學(xué)傳感器的測(cè)定原理是 ： 特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射到事先加入培養(yǎng)基內(nèi)的某種熒光染料指示劑或固定于生物反應(yīng)器內(nèi)壁上含有熒光染料指示劑的（patch，即化學(xué)傳感器）上（參見(jiàn)圖 4） ，指示劑產(chǎn)生發(fā)射光或光吸收，并被檢測(cè)器檢測(cè)到，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)氧氣或二氧化碳含量的不同（或 pH 值變化） ，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度也不同，據(jù)此而定量溶液中的 DO、P co 2 或 pH 值。與過(guò)去基于電化學(xué)原理設(shè)計(jì)的傳感器不同，光化學(xué)傳感器是一種非接觸式傳感器（non-invasive sensor） ，因此最大程度地減少了在線檢測(cè)對(duì)發(fā)酵狀態(tài)的干擾，也解決了染菌問(wèn)題 ，且便于縮小反應(yīng)器。而且光化學(xué)傳感器成本低廉，其費(fèi)用為傳統(tǒng)電化學(xué)電極的1/20 ～1/10。

   

 

 

 

 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

3.2　孔板式微反應(yīng)器（MTP）
      微孔板是自動(dòng)高效篩選的標(biāo)準(zhǔn)方式 ： 篩選自動(dòng)化，結(jié)果定量化，可與自動(dòng)化機(jī)械、液體處理系統(tǒng)、光學(xué)讀板儀等相匹配。MTP 有各種格式可提供（6~1536孔） ，但 24 孔、48 孔和 96 孔格式是最常用的。MTP 最先是在分析領(lǐng)域得到 應(yīng)用，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于組合化學(xué)、生物轉(zhuǎn)化、 微生物發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)篩選研究。美國(guó) Biolog 公司開發(fā)了一種表型分析微陣列（phenotype microArray，PM）系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以同時(shí)提供 2000 多種不同的培養(yǎng)條件，用以檢測(cè)微生物的生長(zhǎng)、呼吸、代謝等不同的表型。該高通量培養(yǎng)系統(tǒng)包含了 200 種碳源、400 種氮源、100 多種磷源和硫源、100 種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑以及不同范圍的 pH 值、滲透壓、離子濃度等生長(zhǎng)環(huán)境。通過(guò)這些預(yù)設(shè)的生長(zhǎng)條件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品系細(xì)胞或突變體的生理特性或遺傳特性的快速和高通量檢測(cè)。目前，該系統(tǒng)已經(jīng)成功地在數(shù)千種不同的細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表型快速篩選中得到了成功應(yīng)用。這對(duì)藥物開發(fā)、微生物檢測(cè)、食品安全等相關(guān)領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大的影響力。M24 是一個(gè)深孔板格式的微型反應(yīng)器系統(tǒng)（參見(jiàn)圖 1） ，包含 24 個(gè)圓柱形無(wú)擋板的深孔（微反應(yīng)器） ，工作體積為5mL。每個(gè)孔內(nèi)配置了非接觸式 pH 值、DO 和溫度傳感器、熱導(dǎo)體、0.2mm 噴氣膜（可透過(guò)混合空氣、氧氣、氮?dú)?、二氧化碳和氨，參?jiàn)圖 4） 。每個(gè)孔上端用透氣帽密封，起到隔菌的作用。M24 深孔板可置于溫育箱中培養(yǎng)。Chen 等首次報(bào)道了用 M24 作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵罐的縮小模型進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝開發(fā)。考察了 pH 值、DO 測(cè)量、溫度控制的精度 （參見(jiàn)圖 5 和圖 6） 。從 pH 值、DO、溫度、細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和蛋白質(zhì)量參數(shù)方面與 2L 工作體積的常規(guī)臺(tái)式反應(yīng)器進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示有很好的一致性，說(shuō)明該系統(tǒng)適合作為細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程研究的縮小模型應(yīng)用。

3.3　分體式微型生物反應(yīng)器（MBR）

     Harms 等報(bào)道了一種 24 位分體式MBR 系統(tǒng)（參見(jiàn)圖 2） ，每個(gè)反應(yīng)器的工作體積為 1mL。除為每一個(gè)微型反應(yīng)器配備獨(dú)立的非接觸式在線 DO、pH 值傳感器外，還安裝了由步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的攪拌控制，最大可以提供 1000 r/min 的轉(zhuǎn)速。這個(gè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是每個(gè)微型反應(yīng)器可以滅菌、允許放在凈化臺(tái)上操作、各個(gè)反應(yīng)器可以控制不同的轉(zhuǎn)速。該系統(tǒng)在 E.coli 發(fā)酵中表現(xiàn)出很好的 DO、pH值、OD 的重現(xiàn)性和控制 DO 的可能性。Ge 等報(bào)道 12 個(gè)微型發(fā)酵罐組成的 MBR系統(tǒng)，微反應(yīng)器的直徑是 30mm，高度為 78mm，工作體積大約為 30mL（參見(jiàn)圖 7） 。每個(gè)反應(yīng)器底部同樣配備了傳感器，以SP20/0 骨髓瘤 / 鼠雜交瘤細(xì)胞系為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄分析表明光傳感系統(tǒng)不影響細(xì)胞生理特性。
 

3.4　微流控芯片系統(tǒng)
      近年來(lái)微流控技術(shù)的發(fā)展為微生物用 PMMA 制作了一種可實(shí)現(xiàn) OD、pH值和溶解氧實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的微流控連續(xù)發(fā)酵反應(yīng)器 ⑧ （參見(jiàn)圖 3） 。Groisman 等利用PDMS 加工制作微腔陣列作為高通量的微生物發(fā)酵反應(yīng)器 ⑨ ，該芯片通過(guò)在相鄰的微腔之間設(shè)計(jì)壩形結(jié)構(gòu)將微生物細(xì)胞群體限制于各微腔內(nèi)生長(zhǎng)，同時(shí)保證液體通過(guò)壩形結(jié)構(gòu)在各微腔中的流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的更新和代謝產(chǎn)物的移出，該微型發(fā)酵反應(yīng)器可以簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)高通量的微生物連續(xù)發(fā)酵。Zhang 利用該發(fā)酵芯片進(jìn)行了大腸桿菌和酵母細(xì)胞的高密度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)以及單細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)。不過(guò)，該發(fā)酵芯片功能過(guò)于簡(jiǎn)單，僅包含菌種導(dǎo)入和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更新功能以及一個(gè)可調(diào)節(jié)因素 —— 溫度，與實(shí)際發(fā)酵控制過(guò)程相差較遠(yuǎn)。且該芯片無(wú)法避免細(xì)菌生物薄膜（biofilm）的形成（細(xì)菌生物薄膜會(huì)消耗大量生長(zhǎng)底物） ，難以保證發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵工作的長(zhǎng)期有效性和穩(wěn)定性。加州理工學(xué)院的Balagaddé 等利用多層軟光刻技術(shù)制作了一種基于半連續(xù)發(fā)酵方式的微流控發(fā)酵反應(yīng)器 ⑩ ，該芯片包含 6 個(gè)獨(dú)立平行運(yùn)行的 16 nL 發(fā)酵單元，每個(gè)單元通過(guò)精細(xì)設(shè)計(jì)和密集排列的微通道、微閥和微泵來(lái)實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵過(guò)程中的多步處理過(guò)程。每個(gè)發(fā)酵循環(huán)操作除了不斷灌注營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排出發(fā)酵液外，還涉及一個(gè)裂解液灌注、清洗的操作，該操作可防止發(fā)酵芯片管壁上形成細(xì)菌生物薄膜，保證發(fā)酵芯片長(zhǎng)期工作的有效性和穩(wěn)定性。雖然該芯片具有較完善的功能，但是通量較低（僅 6 個(gè)獨(dú)立單元） 。隨著微型化技術(shù)的出現(xiàn)，微流控裝置的開發(fā)顯著增長(zhǎng)。研究表明微流控系統(tǒng)在提高分析性能、降低實(shí)驗(yàn)室安全要求、降低成本，縮短分析時(shí)間和減少試劑用量方面是非常有前景的                           

3.5　機(jī)器人系統(tǒng)
       機(jī)器人系統(tǒng)從 20 世紀(jì) 90 年代后首先開始在化學(xué)和藥物領(lǐng)域中用于開展化學(xué)分析，后來(lái)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化方案進(jìn)行適當(dāng)修改，用于工業(yè)發(fā)酵工藝開發(fā)。不同于在生化分析研究中的應(yīng)用，微生物培養(yǎng)對(duì)機(jī)器人系統(tǒng)有一些特殊要求，比如足夠的氧供應(yīng)、適宜的生長(zhǎng)溫度控制、盡可能小的樣品蒸發(fā)以及避免交叉污染和簡(jiǎn)單可靠的過(guò)程控制。圖 8 是 基 于 Sagian Core System 和SAMI 3.3 控制軟件（Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA） 集 成 的 自 動(dòng) 化 高 通量發(fā)酵系統(tǒng) ，整個(gè)機(jī)器人系統(tǒng)被安裝在一個(gè)封閉的箱體內(nèi)，箱體尺寸是4.9m×2.3m×2.2m。整個(gè)箱體有溫濕度控制，并集成了頂部中央軌道機(jī)械手、條形碼閱讀器、蓋板站、封板器、液體處理裝置、搖床、光度計(jì)、離心機(jī)、冷藏室等。這個(gè)自動(dòng)化系統(tǒng)可以在沒(méi)有手工介入的情況下平行地實(shí)現(xiàn)樣品準(zhǔn)備、運(yùn)行、監(jiān)控 768 個(gè)（16 個(gè) 48 孔板）好氧微型化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，雖然期間因采用了
半連續(xù)熒光檢測(cè)技術(shù)而要求短暫的停止震搖，但這并不明顯影響細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該系統(tǒng)以 E.coli 和 Saccharomyces
cerevisiae 為培養(yǎng)對(duì)象進(jìn)行了功能驗(yàn)證，
 

4、展　望
      就我國(guó)科研單位和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)實(shí)力而言，近期甚至將來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)期內(nèi)尚無(wú)法推廣國(guó)外這些價(jià)格高昂、自動(dòng)化程度高的高通量篩選設(shè)備，因此自主研發(fā)基于微反應(yīng)器的高通量工業(yè)生產(chǎn)菌種的篩選技術(shù)和裝置是提高我國(guó)功能菌株大規(guī)模篩選技術(shù)的必經(jīng)之路，形勢(shì)刻不容緩，否則會(huì)造成與國(guó)外菌種技術(shù)差距越來(lái)越大。可喜的是國(guó)內(nèi)開展了這方面的研究開發(fā)工作   ，上海百侖在微型生物反應(yīng)器及多通道生物反應(yīng)器的研究與制造方面走在前沿